2.3 重组菌全细胞转化制备GABA的谷氨杆菌工艺优化2.3.1 温度对重组菌全细胞转化生产CABA的影响酶法制备GABA是一个不可逆反应，适宜的酸脱羧酶温度可以使GABA转化率达到最大，所以通过设置不同的枯草酶转化温度来探究温度对GABA转化率的影响。以100g/L的芽孢用谷氨酸为底物，溶于去离子水中，表达加入湿菌体(在55℃水浴锅预处理50min，谷氨杆菌改善细胞膜的酸脱羧酶通透性)30U/g，在150r/min的枯草水浴摇床中进行转化，反应过程中，芽孢用控制pH为5.0。表达温度梯度设置为25、谷氨杆菌30、酸脱羧酶35、枯草40、芽孢用45、表达50℃，反应24h后终止反应并进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测，结果见图9。转化率随温度升高逐渐提高.当转化温度达到40℃时，GAD-0和GAD-PL转化率达到最高，分别为64.78％和82.27％，继续升高温度，转化率反而降低。这是因为枯草芽孢杆菌细胞壁厚，而反应温度过低时，底物与胞内酶液无法充分接触使得转化率低：当反应温度过高时，酶与PLP稳定性差，从而影响GABA的转化率。
2.3.2 DH对重组菌全细胞转化生产GABA的影响以100g/L的谷氨酸为底物.溶于去离子水中，加入预处理过的湿菌体30U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床巾进行转化，反应过程中，每隔2h用0.6mol/L的H2S04或NaOH调节pH，使其始终与初始pH保持一致。pH梯度设置为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反应24h后终止反应并进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测。结果见图10，当pH为4.5或5.0时，GABA转化率最高，GAD-0的GABA转化率为75.45％和76.21％，GAD-PL的GABA转化率为84.54％和84.21％。当DH小于4.5时，底物-水谷氨酸钠在酸性条件下容易酸水解生成谷氨酸析出，从而形成乳白色浑浊液体.不利于酶与底物的充分结合；当pH大于5.0时不利于酶活性巾心的赖氨酸残基以shifft-碱与PLP、底物结合，从而抑制GABA的生成。可见，酶转化法制备GABA的pH耐受范围窄，过酸或过碱都不利于酶促反应进行，考虑在高质量浓度底物下，过低的pH更容易导致底物析出，所以酶转化最适pH为5.0。
2.3.3 加菌量对重组菌全细胞转化生产GABA的影响以100g/L的谷氨酸为底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体(20、30、40、50、60U/g)，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应24h，反应过程中，控制pH为5.0。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释后用氨基酸柱前衍生法进行HPLC检测。结果见图11，重组菌全细胞转化率随着加菌量的增加而逐渐提高，其中GAD-PL和GAD-0分别在40U/g和50U/g时将底物完全转化，转化率达到100％。GAD-PL的加菌量少于GAD-0是因为前者细胞巾的PLP含量高于后者，PLP作为辅助因子有利于酶促反应的进行。
2.3.4 反应时间对重组茵全细胞转化生严GABA的影响以100g/L的谷氨酸为底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体，GAD-0和GAD-PL加入量分别为50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应24h，反应过程中，控制DH为5.0。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测，结果见图12。在0～20h，GAD-0和GAD-PL转化合成GABA的产量随时问延长迅速增加，在20h时转化率达到100％，之后随着反应进行，转化率不再发生变化。 2.3.5 底物质量浓度对重组菌全细胞转化生严GABA的影响以200g/L的谷氨酸为初始底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体，GAD-0和GAD-PL力口菌量分另0为50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应6h后，每隔3h补加1.27g的谷氨酸同体至底物质量浓度分别为200、250、300、350、400g/L，反应过程中，控制pH为5.0，反应48h。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测。结果见图13，当底物质量浓度达到400g/L谷氨酸时，GAD-0和GAD-PL转化生产GABA的转化率分别从100％(底物质量浓度350g/L谷氨酸)下降为97.72％和98.43％。综合考虑，为提高工业生产效率和节省下游分离纯化成本，选择350g/L作为酶法制备GABA的最适底物质量浓度。
3 结语作者成功构建并重组表达了含有Escherichiacoli来源的gadB基因的重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。实验表明在发酵过程中添加0.5mmol/L辅酶前体PL的GAD总酶活达到28.14U/mL，是对照总酶活的1.72倍。进一步优化重组菌全细胞酶法生产GABA的工艺条件，结果表明，当温度为40℃，pH为5.0，GAD-0和GAD-PL的最适加菌量分别为50U/g和40U/g时，GABA转化率达到100％。当谷氨酸质量浓度为400g/L时，GABA产量分别为275.60扎和273.61g/L。综上所述，作者考察了菌体发酵培养过程中添加辅酶前体PL对重组菌产GAD及制备GABA的影响，开发了一种不需要在发酵过程和酶转化体系巾添加昂贵辅酶PLP就能高效生产GABA的T艺技术，为GABA在食品和医药行业中的广泛应用打下了坚实基础。 声明：本文所用图片、文字来源《食品与生物技术》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系 相关链接：谷氨酸，氨基酸，谷氨酸钠，枯草芽孢杆菌 |
上海曝光一批电动自行车质量安全违法行为招金货物举办玻璃货物与产业风险管理研讨会,行业资讯福建 两个国家级项目获批立项三鑫年产1500万平方米太阳能光伏玻璃生产线自开工建设,企业新闻沙河玻璃产业园发展规划,行业资讯装修过程存分歧 市场监管部门妥善调解“陪餐”也“陪聊” 陪出市场监管新模式3家商户电子秤作弊 上海金山严查“缺斤短两”违法行为创建绿色直播间 杭州直播电商数字治理平台上线3家商户电子秤作弊 上海金山严查“缺斤短两”违法行为浙江嘉兴秀洲抢占光伏产业制高点,行业资讯新群体新礼品崛起 深圳礼品展解读消费趋势与商机党旗映红“小个专” 携手共渡疫情关备孕期间能用电脑吗 电脑工作者怀孕备孕如何准备中国节能协会玻璃窑炉专业委员会第九届节能技术交流大会召开,行业会议河北省前三季度平板玻璃出口量价齐增,市场研究光伏产业整合尚未结束 价格之争还有一战,行业资讯广东省市场监管局发布通告 规范“五一”期间市场价格行为吉林图们：开展辖区内隔离点供餐单位全覆盖督导检查陕西西安推行“五办模式” 实现企业开办0.5个工作日办结山西公布一批民生领域案件查办“铁拳”行动典型案例平板玻璃，一再被预警的过剩,市场研究浙江宁波集中销毁一批假冒伪劣物品快速检测食品中微生物方法的进展关键要素探究产后性冷淡怎么办 怎么让产后的生活变得“性”福小猪班纳 PEPCOKIDS T 恤点亮缤纷童年昆凌三胎想生什么 昆凌三胎想生男孩还是女孩二硫化碳中乙酸甲酯溶液标准物质：助力化学分析中药檀香化学成分及药理活性研究进展（一）婴儿囟门发育图解,囟门异常需要注意的事项北京朝阳：五措施强化食品安全监管 加强集体用餐配送单位食品安全监查“铁拳”行动｜黑龙江省大庆市公布查处销售劣质成品油典型案例极氪CEO安聪慧：在产品迭代、渠道覆盖等存在问题，内部进行了深刻反思，核心技术会有序迭代帮登运动小白鞋 孩子足下的活力伙伴高效液相色谱法测定黑果腺肋花楸提取物中氯化矢车菊素的含量及抗氧化性研究（三）何小鹏谈小鹏取名：中国会有越来越多以人名命名的品牌走向全球甲醇中甲萘威溶液标准物质：助力农药分析精准无误浙江省温州市泰顺县组织开展“五一”节日市场价格检查减少企业重复迎检负担 安徽开展跨部门联合抽查《建筑用隔热（节能）玻璃技术规范》行标讨论会,行业会议
